Coleta, Diluição e Armazenamento de Amostras

Notas Gerais e Recomendações:

O LEAC executa todas as amostras no formato em que são recebidas. Se uma diluição for necessária de acordo com protocolo do kit, será executada pelos nossos técnicos. Se nossos clientes desejarem uma diluição especial, isto deve ser informado no momento de envio das amostras. Através de prévia solicitação, realizamos estudo-piloto para determinar a diluição adequada, se necessário.

O LEAC realiza uma clarificação das amostras ao executar ensaios. A clarificação de amostras melhora significativamente os resultados e evita a maioria dos problemas de amostra que são causadas por detritos celulares e outros contaminantes, como lipídios e bactérias. Como resultado, você terá melhor reprodutibilidade e precisão em seus resultados.

Ao solicitar um ensaio enviamos todas as instruções de como preparar suas amostras para envio. Estes formulários podem ser solicitados através do e-mail - leac@leaclab.com.br

Preparação do soro:

Deixe o sangue coagular a temperatura ambiente por no mínimo 30 minutos.
Após coagulação, centrifugue por 10 minutos a 1000xg a 4 °C.
Aliquotar o soro imediatamente em eppendorfs de 1,5 mL.
Armazenar a ≤ -20°C por até 2 meses. Para períodos maiores armazenar a -80°C.
Evitar o uso de soros hemolizados ou lipêmicos.
Evite múltiplos ciclos de degelo (> 2 ciclos).

Se for dosar GLP-1, Glucagon, e Grelina e Amilina proceder da seguinte forma:

Após coleta da amostra de sangue, inverta o tubo várias vezes para homogeneizar, adicione imediatamente o inibidor DPPIV (para análise de GLP-1), coquetel inibidor de protease (para análise de Amilina), Aprotinina (para dosagem de Glucagon) e Inibidor de serina protease (para dosagem de Grelina ativa). É recomendado o uso do inibidor da EMD Millipore DPPIV Inhibitor (Cat# DPP4), Sigma’s Protease Inhibitor Cocktail e Roche’s Pefabloc SC (AEBSF).

Deixe o sangue coagular por no mínimo 30 minutos antes de centrifugar por 10 minutos a 1000xg. Remover o soro, aliquotar (utilizar eppendorfs de 1,5 mL) e armazenar imediatamente a -20°C.

Evite múltiplos ciclos de degelo (> 2 ciclos).

Entre em contato conosco para obter maiores informações dos inibidores de proteases recomendados. leac@leaclab.com.br

Preparação do Plasma:

A utilização de EDTA como anticoagulante é recomendada para a maioria dos ensaios. Evite usar heparina para ensaios multiplex.
Se utilizar heparina como anticoagulante, não exceda 10 UI por mL de sangue coletado. A heparina pode causar aglutinação das beads e fornecer resultados falsamente altos.
EDTA ou citrato não são recomendados para os ensaios de MMP e TIMP humanos devido à quelação.
Centrifugar a 1000 x g durante 10 min a 4 °C dentro de 30 minutos após a coleta do sangue. Repetir a centrifugação, se necessário.
Separe o plasma imediatamente. Aliquotar e armazenar a ≤ -20°C por até 2 meses. Para períodos maiores armazenar a -80°C.
Evitar o uso de plasma hemolizado ou lipêmico.

Se for dosar GLP-1, Glucagon, e Grelina e Amilina, siga as instruções de inibidores de protease descritas na secção de soro.
• Evite múltiplos ciclos de degelo (> 2 ciclos).

Preparação de sobrenadantes de cultura de tecido

Para sobrenadantes de cultura de células ou extratos de tecidos, enviar o meio de cultura ou extração ao laboratório juntamente com as amostras. Este será utilizado como solução matriz no branco, curvas padrão e controles.
Se as amostras forem diluídas em tampão de ensaio, utilizar o tampão de ensaio como matriz.
Para homogeneizados de células / tecidos, o homogenato final deve ser preparado em um tampão que tenha um pH neutro, e que contenha o mínimo de detergentes ou agentes fortemente desnaturantes e tenha uma força iónica próxima das concentrações fisiológicas. Consulte-nos para listas de tampões incompatíveis com o ensaio Luminex - leac@leaclab.com.br
Centrifugar as amostras a 3000 x g antes de aliquotar (tubo tipo eppendorf 1,5 mL) a fim de remover os detritos.
Transferir o sobrenadante para um novo tubo tipo eppendorf 1,5 mL e armazenar amostras a ≤ -20 °C (1 mês) ou ≤ - 80 °C (para períodos maiores de armazenamento).
Evite múltiplos ciclos de congelamento / descongelamento (> 2 ciclos).
Evitar detritos, lipídeos e agregados de células / tecidos.

Preparação de Homogenato de Tecido:

Homogeneizar o tecido em PBS ou tampão equivalente contendo inibidores de protease (como aprotinina ou um coquetel inibidor) e baixa (≤ 0,5%) concentração de detergente não iônico.
Evite usar SDS ou outros agentes desnaturantes. Se SDS for necessário, não exceda 0,1%.
Exemplo de tampões: Tris HC1 20 mM (pH 7,5), Tween 20 a 0,5%, NaCl 150 mM, inibidores de protease Sigma 1: 100. Consulte-nos para listas de tampões incompatíveis com o ensaio Luminex - leac@leaclab.com.br
O tampão RIPA é também um tampão comumente utilizado para os nossos ensaios.
Uma vez homogeneizados os tecidos, centrifugar a 10 000 x g durante 10 minutos a 4 °C e transferir o sobrenadante para um tubo do tipo eppendorf - 1,5mL.
As amostras devem ser normalizadas para conter uma quantidade igual de proteínas. Normalizar as amostras com base em ensaios de proteína total. A normalização de dados não é recomendada. Procure uma concentração mínima de proteína de 400ug /mL.
Armazenar amostras a ≤ -20 ° C (durante 1 mês) ou ≤ - 80 ° C (para períodos mais longos). E
Evite múltiplos ciclos de degelo (> 2 ciclos).

Células em Suspensão:

Transferir as células para um tubo cônico de 15 ml e centrifugar a 500 x g a 4 ° C durante cinco minutos.
Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e suspender as células em PBS gelado.
Repita este passo utilizando PBS gelado e centrifugue novamente a 500 x g a 4 ° C durante 5 minutos.
Remova completamente todo o PBS.
Lise as células em um tampão a base de PBS contendo inibidores de protease (como aprotinina ou um coquetel inibidor) e baixa (<0,2%) concentração de detergente não iónico. Consulte-nos para listas de tampões incompatíveis com o ensaio Luminex - leac@leaclab.com.br
Se possível, evite usar SDS ou outros agentes desnaturantes.
Se for necessário SDS, não use mais do que 0,1%.
O meio de extração também não deve conter quaisquer solventes orgânicos como DMSO.
Exemplo de tampão: Tris-HCl: 50 mM, NaCl: 150 mM, 0,5% NP-40, EDTA: 1 mM, Aprotinina: 1 mg / ml, pH 7,4.
Centrifugar o extrato a 10.000 x g por 10 minutos a 4 ° C.
Transferir o sobrenadante para um novo tubo do tipo eppendorf - 1,5mL e armazenar amostras a ≤ -80 ° C.
Evite múltiplos ciclos de degelo (> 2 ciclos).

Escarro:

Retire o material sólido com ultracentrifugação em alta velocidade.
Antes da centrifugação, pode ser necessário adicionar um produto químico para liquefazer amostras viscosas (ou seja, hialuronidase) ou adicionar um tampão de diluição (PBS pH ~ 7,5) para fazer uma diluição de 2-4 vezes.
Alíquotar para tubo do tipo eppendorf - 1,5mL e armazenar amostras a ≤ - 80 ° C.
Evite múltiplos ciclos de degelo (> 2 ciclos).

Fluído BAL:

Retire o material sólido com ultracentrifugação em alta velocidade.
Pode ser adicionado BSA 1% em PBS para evitar a perda de amostra.
Transferir o sobrenadante para tubo do tipo eppendorf - 1,5mL e armazenar amostras a ≤ - 80 ° C.
Evite múltiplos ciclos de degelo (> 2 ciclos).

Fluido sinovial

Para tratar a alta viscosidade do líquido sinovial diluir a amostra 4 vezes usando PBS pH ~ 7,5 ou adicionar um produto químico para liquefazer amostras viscosas (ou seja, hialuronidase).
Aliquotar para para tubo do tipo eppendorf - 1,5mL e armazenar amostras a ≤ - 80 ° C.
Evite múltiplos ciclos de degelo (> 2 ciclos).

Urina:

Tipicamente, a dosagem de analitos na urina requer uma coleta de urina de 24 horas ou a coleta do segundo jato de urina pela manhã.
Para segundo jato de urina pela manhã, é comum normalizar o valor do analito contra a creatinina (ou seja, você expressa o resultado do analito como unidades / mg de creatinina).
Remover os sedimentos por centrifugação.
Transferir o sobrenadante para tubo do tipo eppendorf - 1,5mL e armazenar amostras a ≤ -80 ° C.
Evite múltiplos ciclos de degelo (> 2 ciclos).

Para outros tipos de amostra: entre em contato conosco - leac@leaclab.com.br